在生命微觀尺度下，蛋白質(zhì)是極為關(guān)鍵的生物大分子，廣泛參與細胞結(jié)構(gòu)維系、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、新陳代謝催化、信號傳導(dǎo)調(diào)控等生命活動，是生命活動的重要基石。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮依賴蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI），PPI參與細胞內(nèi)眾多生理過程，如基因表達調(diào)控、信號傳導(dǎo)調(diào)控等。以信號傳導(dǎo)為例，細胞接收信號后通過蛋白質(zhì)間有序的相互作用傳遞放大信號，引發(fā)生理響應(yīng)，因此PPI是細胞正常生理功能實現(xiàn)的核心機制，異常時易引發(fā)多種疾病。探究其作用機制和規(guī)律是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要課題。
蛋白質(zhì)相互作用可以分為穩(wěn)定相互作用和瞬時相互作用兩種類型。這兩種類型的相互作用均存在強弱差異。
穩(wěn)定相互作用主要存在于多亞基復(fù)合物中，這類相互作用可通過免疫共沉淀或Pull down等方法鑒定。
瞬時相互作用參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾、運輸、折疊、信號傳導(dǎo)、細胞周期等多數(shù)生理過程，通常作為生理過程的“分子開關(guān)"發(fā)揮臨時調(diào)控作用，其結(jié)合強度可強可弱、作用時間可長可短，但一般需要特定條件觸發(fā)。瞬時相互作用可通過交聯(lián)或標記轉(zhuǎn)移等方法來檢測。
接下來我們一起了解在生命科學(xué)研究中檢測蛋白間相互作用的常用方法。
（一）技術(shù)簡介
酵母雙雜交技術(shù)是蛋白互作研究的經(jīng)典方法，起源于20世紀80年代末。它利用酵母轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）的結(jié)構(gòu)特征檢測蛋白互作——這類轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）組成，僅當二者空間靠近時才能激活報告基因轉(zhuǎn)錄。在該系統(tǒng)中，將待檢測的兩種蛋白分別與BD、AD融合，構(gòu)建成誘餌蛋白（BD-靶蛋白）和獵物蛋白（AD-待測蛋白）并導(dǎo)入酵母細胞表達。若兩種蛋白發(fā)生互作，BD與AD將在空間上靠近，使BD結(jié)合到報告基因上游的激活序列（UAS），同時AD激活下游報告基因（如HIS3、LEU2等營養(yǎng)缺陷型基因或β-半乳糖苷酶基因）的轉(zhuǎn)錄。通過觀察酵母在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上的生長情況，或檢測β-半乳糖苷酶的顯色活性（如X-Gal染色），即可判斷蛋白間是否存在互作。
（二）實驗注意事項
1. 在構(gòu)建載體時，要確保融合蛋白的正確表達，避免因基因插入錯誤或表達異常導(dǎo)致實驗失??；
2. 要對誘餌蛋白進行自激活檢測，防止其自身激活報告基因，產(chǎn)生假陽性結(jié)果；
3. 在篩選文庫時，要設(shè)置合適的對照，如陽性對照和陰性對照，以準確判斷實驗結(jié)果；
4. 由于酵母細胞的生長狀態(tài)對實驗結(jié)果有影響，所以要保證酵母感受態(tài)細胞的質(zhì)量，操作過程也要嚴格按照無菌要求進行，防止雜菌污染。
（三）優(yōu)勢與局限
?優(yōu)勢：
1. 高通量篩選能力：可從 cDNA 文庫（含數(shù)萬克?。┲写笠?guī)模篩選互作蛋白，適用構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)；
2. 模擬體內(nèi)環(huán)境：在酵母細胞內(nèi)檢測互作，保留蛋白折疊與核定位等生理條件，適合核蛋白互作分析；
3. 操作簡便：無需純化蛋白，通過報告基因（如營養(yǎng)缺陷、顯色反應(yīng)）表型篩選，適合實驗室常規(guī)應(yīng)用；
4. 檢測直接互作：可鑒定蛋白間的直接相互作用，無需依賴第三方因子（如抗體）。
?局限：
1. 假陽性/假陰性率高：約30%-50%陽性克隆為非特異性互作（如自激活現(xiàn)象），膜蛋白、分泌蛋白等因無法進入細胞核易漏檢；
2. 依賴蛋白表達與定位：核蛋白互作檢測效率高，胞質(zhì)/膜蛋白需進行特殊改造（如使用膜系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)）；
3. 無法檢測動態(tài)互作：報告基因表達需數(shù)小時至數(shù)天，難以捕捉瞬時/弱互作（如信號通路中的動態(tài)結(jié)合）；
4. 物種局限性：哺乳動物蛋白可能因糖基化、磷酸化等翻譯后修飾差異，可能導(dǎo)致互作失敗。
免疫共沉淀（Co-IP）是在細胞裂解液體系中驗證蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，能在細胞內(nèi)天然狀態(tài)下捕獲相互作用的蛋白質(zhì)。其原理是基于抗體對目標蛋白表位的特異性識別。細胞裂解后，向裂解液加入針對目標蛋白的特異性抗體，抗體與目標蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物，再利用能與抗體Fc段特異性結(jié)合的介質(zhì)（如ProteinA/G瓊脂糖珠）沉淀免疫復(fù)合物。經(jīng)多次洗滌去除雜質(zhì)蛋白，最后用Western Blotting分析沉淀所得的蛋白復(fù)合物，或者使用質(zhì)譜檢測與目標蛋白相互作用的潛在蛋白。
（二）實驗注意事項
1. 抗體選擇：使用高特異性、高親和力的IP抗體，可通過Western blot預(yù)實驗檢測抗體對目標蛋白的表位識別能力，驗證無明顯非特異性條帶。需根據(jù)抗體種屬選擇匹配的 Protein A/G 介質(zhì)，避免因Fc段結(jié)合效率低導(dǎo)致沉淀失敗。
2. 樣品制備：使用新鮮細胞或組織（避免反復(fù)凍融），根據(jù)目標蛋白選擇裂解液（如NP-40或RIPA），添加蛋白酶/磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解或修飾丟失，裂解后迅速離心取上清，去除細胞碎片。
3. 對照設(shè)置：陰性對照：同型IgG或空載體轉(zhuǎn)基因材料；Input對照：驗證目標蛋白在樣品中表達。
4. 結(jié)合條件優(yōu)化：調(diào)整抗體和磁珠/瓊脂糖的比例，避免過量抗體導(dǎo)致非特異性結(jié)合，優(yōu)化孵育時間（通常4℃過夜）和溫度。
5. 洗滌條件：根據(jù)實驗調(diào)整洗滌緩沖液鹽濃度，如用含 Triton X-100的低鹽/高鹽緩沖液（如PBS+0.1%Triton X-100）梯度洗滌，去除非特異性結(jié)合，同時避免強洗滌條件破壞蛋白復(fù)合物。
（三）優(yōu)勢與局限
?優(yōu)勢：
1. 生理相關(guān)性強：在細胞內(nèi)天然狀態(tài)下檢測蛋白互作，保留翻譯后修飾（如磷酸化、泛素化）和亞細胞定位信息，更貼近生理環(huán)境（區(qū)別于體外Pull-down技術(shù)）。
2. 樣本適用性廣：可用于細胞裂解液、組織樣本（如冰凍/石蠟切片組織提取液），甚至轉(zhuǎn)基因動物的體液樣本，兼容內(nèi)源蛋白和外源表達蛋白的檢測。
3. 操作兼容性高：結(jié)合質(zhì)譜（MS）可篩選未知互作蛋白，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，通過WB能特異性驗證已知互作蛋白。
?局限：
1. 間接互作干擾：檢測到的蛋白復(fù)合物可能是通過第三方因子連接的間接結(jié)合，無法直接證明兩蛋白的物理結(jié)合，需結(jié)合體外Pull-down實驗或酵母雙雜交驗證直接互作。
2. 低豐度蛋白限制：對低表達蛋白的敏感性不足，需要增加樣本投入量或借助交聯(lián)劑固定（但可能增加非特異性結(jié)合風險）。
3. 抗體依賴性強：抗體質(zhì)量直接影響結(jié)果，可能漏檢某些互作（如表位被遮蔽）或產(chǎn)生假陽性（非特異性結(jié)合）。
4. 動態(tài)互作捕捉難：難以捕獲瞬時或弱相互作用（如激酶-底物的短暫結(jié)合），需優(yōu)化孵育時間或使用交聯(lián)劑（如甲醛）固定。
（一）技術(shù)簡介
Pull-down實驗是體外研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，基于親和層析原理，能捕獲并鑒定與目標蛋白（誘餌蛋白）相互作用的其他蛋白。流程為：先將誘餌蛋白與特定標簽（如GST、His、Halo、Flag等）融合表達，利用親和層析純化融合蛋白，隨后，將純化的融合蛋白通過標簽與固相支持物上配體特異性結(jié)合，形成固定化的誘餌蛋白。然后將含獵物蛋白的細胞裂解液或蛋白溶液，與固定化誘餌蛋白孵育，通過洗去未結(jié)合蛋白，捕獲具有相互作用的蛋白復(fù)合物。最后洗脫分離結(jié)合的蛋白復(fù)合物，可使用Western Blotting驗證已知互作蛋白或質(zhì)譜分析篩選未知互作蛋白。
（二）實驗注意事項
1. 蛋白表達純化：根據(jù)需求選擇原核（如E.coli，表達需注意蛋白可溶性，避免包涵體形成）或者真核（如HEK293、昆蟲細胞等，適合復(fù)雜修飾的蛋白）表達系統(tǒng)。
2. 樣本制備：裂解液的成分需根據(jù)研究對象進行優(yōu)化，過高濃度的去垢劑可能破壞蛋白-配體的相互作用，樣本需充分離心或過濾，去除細胞碎片等雜質(zhì)。
3. 配體與基質(zhì)選擇：配體的親和力和特異性直接影響實驗結(jié)果，需通過預(yù)實驗篩選最佳配體；基質(zhì)應(yīng)選擇非特異性吸附低的類型，并嚴格控制配體的偶聯(lián)效率和密度。
4. 對照設(shè)置：設(shè)置陰性對照（如空載表達的蛋白或無關(guān)配體），陽性對照（已知與配體結(jié)合的蛋白），input對照（同步檢測目標蛋白表達量，確保樣本制備一致性），以確保實驗結(jié)果的可靠性。
（三）優(yōu)勢與局限
?優(yōu)勢：
1. 無需抗體：僅需將誘餌蛋白標記（如GST、His等標簽），避免因抗體特異性差或者制備困難導(dǎo)致的實驗阻礙，尤其適用于無商業(yè)化抗體的蛋白研究。
2. 靈活性高：可精準設(shè)計誘餌蛋白的突變體、結(jié)構(gòu)域或翻譯后修飾（如磷酸化位點突變），研究結(jié)構(gòu)、修飾等對互作的影響。
3. 樣本兼容性廣：適用于原核/真核表達蛋白、細胞裂解液、合成多肽（如抗原表位肽），或者化學(xué)合成的小分子配體。
4. 應(yīng)用范圍廣：可用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、小分子化合物、核酸等多種配體的相互作用，在藥物靶點發(fā)現(xiàn)、信號通路機制研究等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。
?局限：
1. 非特異性背景干擾：配體或基質(zhì)可能非特異性吸附蛋白，導(dǎo)致假陽性信號。需通過陰性對照（空標簽基質(zhì)）和BSA封閉基質(zhì)降低背景。
2. 低豐度蛋白檢測困難：對于細胞內(nèi)低表達的蛋白質(zhì)，由于親和捕獲效率有限，可能難以有效富集，影響檢測靈敏度。
3. 無法區(qū)分直接與間接相互作用：實驗捕獲的蛋白復(fù)合物中，可能包含與目標蛋白間接結(jié)合的蛋白，需要進一步進行點對點實驗來驗證兩蛋白是否直接互作。
4. 動態(tài)互作捕捉難：體外孵育時間通常 2-4 小時，無法模擬細胞內(nèi)瞬時互作（如激酶 - 底物結(jié)合僅數(shù)秒）。
5. 表達系統(tǒng)限制：原核表達缺乏真核修飾（如糖基化），可能影響互作真實性，可采用無細胞真核表達系統(tǒng)保留翻譯后修飾。藍景科信為您提供無細胞真核表達系統(tǒng)選擇，表達成功率高，周期短，表達蛋白更接近體內(nèi)蛋白情況。
（一）技術(shù)簡介
雙分子熒光互補（BiFC）技術(shù)能直觀、快速地判斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用。其原理是將熒光蛋白（如綠色熒光蛋GFP、黃色熒光蛋YFP 等）在特定位點分割成無熒光活性的N端和C端片段，再將這兩個片段分別與待測的兩種目標蛋白融合，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化導(dǎo)入活細胞表達。當目標蛋白發(fā)生相互作用時，會帶動兩個熒光蛋白片段靠近重組，恢復(fù)熒光活性并發(fā)光。借助熒光顯微鏡能直接觀測熒光信號在細胞內(nèi)的位置和強度，從而確定蛋白間的相互關(guān)系及其亞細胞定位。
（二）實驗注意事項
1. 載體設(shè)計優(yōu)化：在目標蛋白與熒光片段之間添加柔性連接肽，通過增加空間自由度減少熒光片段對蛋白互作的位阻效應(yīng)，避免干擾蛋白功能。
2. 表達水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽性，平衡兩種蛋白表達效率。
3. 嚴格對照：設(shè)單獨片段對照，排除片段自發(fā)互補的可能，添加陰性和陽性對照。
4. 檢測條件：熒光信號通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時間，建議在24-48小時內(nèi)完成成像，避免超過72小時因蛋白過飽和聚集產(chǎn)生假陽性，針對不同熒光蛋白設(shè)置合適激發(fā)/發(fā)射波長。
（三）優(yōu)勢與局限
?優(yōu)勢：
1. 直觀可視化：通過熒光顯微鏡（如共聚焦）實時觀測蛋白互作的亞細胞定位（如細胞膜、細胞核、細胞質(zhì)囊泡等），直接關(guān)聯(lián)互作事件與細胞功能區(qū)域。
2. 高特異性：僅當兩蛋白距離<10 nm時，熒光蛋白N/C端片段才能重構(gòu)成完整β-barrel構(gòu)并恢復(fù)熒光，降低假陽性。
3. 適用于弱/瞬時互作：熒光互補后形成穩(wěn)定發(fā)色團，可將短暫互作（如激酶-底物結(jié)合數(shù)秒）轉(zhuǎn)化為持續(xù)熒光信號，通過累計效應(yīng)提升檢測靈敏度。
4. 多系統(tǒng)兼容：動物細胞、植物細胞及模式生物體內(nèi)均可應(yīng)用，適用于原生質(zhì)體、組織切片及活體幼體等多種樣本類型。
5. 多色擴展應(yīng)用：利用不同光譜的熒光蛋白（如GFP/YFP/CFP/RFP），通過光譜拆分技術(shù)實現(xiàn)2-3對互作的同時可視化分析。
?局限：
1. 不可逆互補：熒光蛋白互補后形成共價或非共價穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，無法反映動態(tài)解離過程。
2. 假陽性風險：過表達可能導(dǎo)致蛋白非生理性聚集或片段自發(fā)互補（需單轉(zhuǎn)片段對照）。
3. 靈敏度限制：弱互作可能信號微弱，需搭配高靈敏度設(shè)備（如共聚焦顯微鏡）或信號放大系統(tǒng)（如mCherry標簽串聯(lián)）。
4. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光蛋白片段插入可能影響目標蛋白的折疊或亞細胞定位。
5. 光穩(wěn)定性問題：常用熒光蛋白（GFP/YFP）在高強度光照下易發(fā)生光漂白（半衰期約 5-10 分鐘），需采用低光強成像+快速掃描或添加抗淬滅劑。
（一）技術(shù)簡介
熒光素酶互補實驗基于熒光素酶的特性來檢測蛋白質(zhì)的相互作用。原理是將熒光蟲熒光素酶（如Firefly luciferase）拆分成兩個無活性的N端和C端片段，再分別與待檢測的兩種目標蛋白融合表達。當目標蛋白發(fā)生相互作用時，兩個熒光素酶片段靠近重構(gòu)為有活性的酶，再加入熒光素底物可催化底物反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光信號，通過檢測發(fā)光信號強度即可判斷蛋白間是否存在相互作用及作用強度。
（二）實驗注意事項
1. 載體設(shè)計優(yōu)化：在目標蛋白與熒光素酶片段之間添加柔性連接肽，通過增加空間自由度減少位阻效應(yīng)，避免干擾蛋白功能。
2. 表達水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽性，平衡兩種蛋白表達效率。
3. 嚴格對照：設(shè)單獨片段對照，排除片段自發(fā)互補的可能，添加陰性和陽性對照。
4. 檢測條件：熒光信號通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時間，建議在24-48小時內(nèi)完成成像，避免超過72小時因蛋白過飽和聚集產(chǎn)生假陽性。發(fā)光信號半衰期約30分鐘，需在添加底物后5-10分鐘內(nèi)完成檢測，并設(shè)置復(fù)孔（n≥3）降低誤差。
（三）優(yōu)勢與局限
?優(yōu)勢：
1. 高靈敏度：可檢測弱或瞬時互作（如NanoLuc信號強度比Firefly高100倍）。
2. 定量性強：化學(xué)發(fā)光信號線性達7-8個數(shù)量級，適用于定量分析互作親和力及藥物對互作的抑制/激活效應(yīng)）。
3. 活細胞/體內(nèi)應(yīng)用：適用于植物（如煙草葉片瞬時表達） 和動物模型（如小鼠腫瘤細胞活體成像）。
4. 無自發(fā)熒光干擾：生物發(fā)光無需激發(fā)光，避免細胞自發(fā)熒光（如葉綠素、膠原蛋白）和熒光蛋白的光漂白問題。
?局限：
1. 不可逆互補：熒光素酶片段互補后形成穩(wěn)定的催化構(gòu)象，解離半衰期>24小時，無法反映生理條件下的動態(tài)解離過程（如激酶-底物的互作）。
2. 過表達假陽性：高濃度蛋白可能導(dǎo)致非生理性聚集（需控制表達量并驗證內(nèi)源互作，設(shè)置單轉(zhuǎn)片段對照）。
3. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光素酶片段融合可能影響目標蛋白的折疊或亞細胞定位。
4. 光穩(wěn)定性問題：發(fā)光信號在添加底物后30分鐘內(nèi)衰減50%（如螢火蟲熒光素酶），需在5-15分鐘內(nèi)完成檢測，不適合長時間互作追蹤。
六、表面等離子共振（SPR）
（一）技術(shù)簡介
SPR是一種基于光學(xué)原理的無標記生物分子相互作用分析技術(shù)，核心原理是：
當一束偏振光以臨界角入射到玻璃棱鏡與金屬膜（通常為金膜）的界面時，會發(fā)生全反射并產(chǎn)生消逝波。若金屬膜表面固定的靶分子（如受體、抗體）與溶液中的分析物（如配體、抗原）發(fā)生結(jié)合，會引起金屬膜表面的折射率變化，進而導(dǎo)致反射光的共振角偏移。通過監(jiān)測共振角偏移量（ΔRU，響應(yīng)單位），可實時定量分析分子間的結(jié)合/解離動力學(xué)過程及親和力強弱。
1.核心組件
2. 關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)
響應(yīng)單位（RU）：1RU≈1ng/mm2 的分子質(zhì)量變化，反映結(jié)合分子的量。
動力學(xué)參數(shù)：
結(jié)合相（Association）：分析物與靶分子結(jié)合的速率（kon，單位：M?1?s?1）。
解離相（Dissociation）：結(jié)合復(fù)合物解離的速率（koff，單位：s?1）。
平衡解離常數(shù)（KD）：反映親和力，KD越小，親和力越強（如KD<10?9M為高親和力）。
檢測范圍：可檢測低至nM級的親和力（如瞬時互作）和快至秒級的動力學(xué)過程。
（二）實驗注意事項
1. 在固定配體時，要保證配體的活性和固定的穩(wěn)定性，避免配體在實驗過程中脫落或失活。同時，要優(yōu)化樣品的濃度和流速，以獲得最佳的信號響應(yīng) 。
2. 由于SPR信號容易受到外界環(huán)境因素的影響，如溫度、溶液中的雜質(zhì)等，所以實驗過程中要保持環(huán)境的穩(wěn)定，使用高質(zhì)量的緩沖液和純凈的樣品。
3. 在數(shù)據(jù)分析時，要選擇合適的擬合模型，根據(jù)實驗?zāi)康暮蛿?shù)據(jù)特點進行參數(shù)計算，避免因模型選擇不當導(dǎo)致結(jié)果偏差 。
（三）優(yōu)勢與局限
?優(yōu)勢：
1. 無標記：無需熒光/同位素標記，保留分子天然構(gòu)象。
2. 實時動態(tài)：直接監(jiān)測結(jié)合-解離全過程，提供動力學(xué)參數(shù)。
3. 高靈敏度：可檢測低至pg級的分子結(jié)合（如單克隆抗體）。
4. 高通量：搭配自動進樣器可實現(xiàn)批量樣品分析。
?局限：
1. 需純化分子：靶蛋白和分析物需高度純化（不適用于細胞裂解液等復(fù)雜體系）。
2. 儀器成本高：商用SPR設(shè)備（如Biacore系列）價格通常在百萬級別。
3. 固定效應(yīng)：靶蛋白固定可能影響其構(gòu)象，導(dǎo)致假陰性 / 假陽性結(jié)果。
蛋白互作不同方法的比較
上述介紹了6種常用的蛋白質(zhì)互作研究方法。不同技術(shù)的檢測原理、實驗條件及靈敏度存在差異，可能導(dǎo)致結(jié)果不一致。建議根據(jù)研究目標（如篩選、驗證、定量或定位）和樣品特性（如蛋白亞細胞定位、互作強弱），選擇單一方法或聯(lián)合多種技術(shù)交叉驗證。
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