實驗流程

1.試劑準備
1.1.實驗前應(yīng)用力振蕩幾次預(yù)分裝深孔板，避免液體殘留在封口膜上。檢查溶液是否有沉淀，磁珠是否能重懸。
2.操作步驟
2.1.根據(jù)不同樣本類型選擇對應(yīng)步驟進行處理
A.病毒、支原體、衣原體類核酸提取：取200~300 μL液體樣本、20 μL蛋白酶K直接加至預(yù)分裝深孔板第1/7列的孔中，按照步驟2.4操作直接上機提取，無需進行前處理。
B.非真菌類、易裂解微生物核酸提取：取350~400 μL液體樣本至研磨管中，加入40 μL裂解加強液、20 μL蛋白酶K,高速渦旋1分鐘混勻。
?易裂解細菌：革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、百日咳桿菌等。
C.真菌類、難裂解微生物核酸提?。喝?50~400 μL液體樣本至研磨管中，再加入40 μL裂解加強液、20 μL蛋白酶K，在渦旋儀最大轉(zhuǎn)速渦旋30分鐘或轉(zhuǎn)移至震蕩破碎儀高速研磨樣本10分鐘(不同品牌震蕩破碎儀，請選擇儀器推薦程序)。
?真菌：白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、黃曲霉、青霉菌。
?難裂解細菌：革蘭氏陽性菌如葡萄球菌、霉菌、肺炎鏈球菌等。
注意事項：
?拭子類保護液可能含有高濃度胍鹽，會與裂解加強液反應(yīng)導致提取效果不佳；如確需提取該類樣本，無需加入裂解加強液，步驟2.1處理完后，按照步驟2.4繼續(xù)操作。
?全血樣本：如臍帶血，骨髓血這些細胞含量高的全血，提取過程中可能會出現(xiàn)磁珠殘留或顏色殘留，建議將樣本用生理鹽水或PBS稀釋后再進行核酸提取，或聯(lián)系廠家推薦其它試劑和方案。
?痰液樣本：提取過程中容易出現(xiàn)磁珠殘留，建議將樣本用生理鹽水或PBS稀釋后再進行核酸提取。
2.2.轉(zhuǎn)至水浴鍋或干式恒溫儀中，70℃溫浴20分鐘進一步裂解樣本，裂解后取出渦旋混勻30秒。
2.3.若裂解后溶液出現(xiàn)渾濁，10,000×g離心1分鐘；若裂解后溶液清澈透明，瞬時離心30秒即可。
備注：如木霉菌等真菌離心后上清有顏色，可額外購買我司沉淀液SPS，按以下流程操作：取300 μL離心后上清到新的離心管中，加入100 μL沉淀液SPS混勻后，4℃冰浴10分鐘，10,000×g離心3分鐘后取上清上機。
2.4.對于32通道全自動核酸提取儀 （儀器型號：Mypure 32）
2.4.1.把預(yù)分裝深孔板平放于桌面，輕輕拍打幾下讓孔壁上的液滴滴回孔中，小心去除封口膜。
2.4.2.吸取200~300 μL步驟2.3的上清溶液，加入預(yù)分裝深孔板第1/7列的孔中，小心吸取，避免吸到沉淀或玻璃珠，每塊預(yù)分裝深孔板可以處理16個樣本。
2.4.3.將深孔板放入核酸提取純化儀的底座卡位上，在磁棒套卡槽中插入8聯(lián)磁棒套，選擇“病原微生物總核酸提取"程序，依次點擊打開-準備運行進行提取。
注意：即使只提取1個樣本，也需要裝上2個8聯(lián)磁棒套，以避免磁棒直接接觸試劑。
注意：保持深孔板以第1列在左，第12列在右的方向放入底座卡位，如放置錯誤，無法獲得核酸。
2.4.4.提取的核酸在第6/12列的孔中，如果不立即使用，請轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌無核酸酶的離心管中，存儲于-15~-25℃，長期保存請放置于-70℃或更低的溫度。
注意：在進行下游PCR或QPCR檢測前，對于雙鏈RNA病毒如輪狀病毒、傳染性胰壞死病毒、傳染性法氏囊病病毒、果蠅的X病毒、雙瓣軟體動物的Tellina病毒(TV)和牡蠣病毒(Oyster virus，OV)等，建議先將雙鏈RNA經(jīng)90℃變性5分鐘后，迅速降溫至4℃，再進行逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)PCR。